Proyecto de investigación
Dependencias tróficas en el sistema oculomotor. Efectos de factores derivados de la diana en la regulación de propiedades funcionales neuronales en modelos de lesión central y periférica.
Responsable: Ángel Manuel Pastor Loro
Tipo de Proyecto/Ayuda: Plan Nacional del 2009
Referencia: BFU2009-07121
Fecha de Inicio: 01-01-2010
Fecha de Finalización: 31-12-2013
Empresa/Organismo financiador/es:
- Ministerio de Ciencia e Innovación
Equipo:
- Investigadores:
- Otros Investigadores:
Contratados:
- Investigadores:
- Técnicos/Personal Administrativo:
Resumen del proyecto:
El presente proyecto de investigación ha evaluado la potencialidad de diferentes estrategias terapéuticas dirigidas a la recuperación funcional tras la lesión de neuronas centrales (premotoras ) o periféricas (motoneuronas) en mamíferos adultos (gatos y ratas). Para ello hemos utilizado el sistema oculomotor como modelo experimental debido a la facilidad de medir el comportamiento celular y motor bajo condiciones normales y alteradas. En concreto, se han utilizado dos estrategias conducentes a minorar las alteraciones producidas por la axotomía. De un lado, se han estudiado las consecuencias del tratamiento con factores neurotróficos en motoneuronas axotomizadas y, de otro lado, se han analizado los efectos del implante de células progenitoras neurales (i.e., células madre pluripotenciales) tras la sección de un fascículo central troncoencefálico. Por último, otro objetivo del presente proyecto ha sido evaluar las consecuencias de la sección de dos tractos aferentes a motoneuronas oculomotoras con el fin de determinar el grado de plasticidad sináptica y los cambios y grado de compensación producidos tras la lesión de cada tracto. Los principales resultados obtenidos se resumen a continuación, siguiendo los objetivos concretos presentados en el proyecto.
1.- Administración exógena del factor de crecimiento nervioso (NGF) a las motoneuronas del núcleo abducens tras su axotomía. Las motoneuronas del núcleo abducens inervan el músculo extraocular recto lateral homolateralmente. Sus axones cursan por el VI par craneal. Tras realizar la sección del nervio a su entrada en el músculo (axotomía) se procedió a administrar a través de un dispositivo intraocular la neurotrofina NGF a las motoneuronas axotomizadas. Inicialmente demostramos mediante inmunocitoquímica que las motoneuronas del abducens expresan los dos tipos de receptores del NGF, el de alta afinidad o trkA y el de baja afinidad o p75. La axotomía produjo en las motoneuronas una serie de alteraciones en su patrón de disparo y una pérdida de entradas sinápticas, según evaluamos mediante registros crónicos en el animal alerta y técnicas inmunocitoquímicas a nivel de microscopía confocal. El resultado más interesante que se encontró tras el tratamiento con NGF fue el restablecimiento de la modulación del disparo y las entradas sinápticas en las motoneuronas axotomizadas. No obstante, algunas propiedades neurofisiológicas mostraron valores por encima del control, como la sensibilidad a la posición y a la velocidad ocular, y la variabilidad de la tasa de disparo durante fijaciones oculares. Posteriormente se determinó la vía de señalamiento que utiliza el NGF en las motoneuronas axotomizadas para lograr sus efectos. Para ello tras 15 días de tratamiento con solo NGF se procedió a administrar junto con el NGF o bien un bloqueante selectivo de los receptores trkA (K252a) o bien un inhibidor de los receptores p75 (REX). Los resultados obtenidos apuntan a que el NGF media distintos aspectos de la fisiología motoneuronal dependiendo del receptor activado. En concreto, la activación del receptor trkA resulta esencial para recuperar las entradas sinápticas y la modulación del disparo en relación a los movimientos oculares. Por otro lado, la activación de la vía intracelular mediada por el receptor p75 regula el umbral de reclutamiento y la regularidad del disparo. En resumen, la administración de NGF, actuando a través de sus dos tipos de receptores, consigue recuperar en un alto grado las alteraciones inducidas en las motoneuronas tras la lesión.
2.- Implante de progenitores neurales tras la sección del fascículo longitudinal medial: respuesta fisiológica en las neuronas axotomizadas. El núcleo abducens contiene, además de las motoneuronas, otro tipo neuronal, las denominadas neuronas internucleares, cuyos axones cursan a lo largo del fascículo longitudinal medial y terminan en el núcleo oculomotor. Estas neuronas son las responsables de la conjugación de los movimientos oculares en el plano horizontal. La sección del fascículo longitudinal medial produce la axotomía de las neuronas internucleares del abducens y se ve acompañada de una notable disminución en el disparo de estas neuronas, una pérdida de las señales relacionadas con los movimientos oculares, así como de las entradas sinápticas. Con el objeto de comprobar si las alteraciones inducidas por la axotomía podían prevenirse implantando progenitores neurales, procedimos a implantar estas células en el sitio de lesión en el fascículo y a realizar el estudio neurofisiológico subsiguiente. Los resultados obtenidos indican que el implante se integra adecuadamente en el tejido hospedador, donde la mayoría de sus células permanecen en un estadío indiferenciado pero son capaces de producir factores neurotróficos, destacando el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). También se observó que las neuronas internucleares aumentan su contenido en VEGF y que expresan el receptor de VEGF Flk-1. Por otro lado, los registros crónicos mostraron que el disparo de las neuronas internucleares tras el implante mantuvo la modulación típica observada en los controles y que las sensibilidades neuronales a la posición y a la velocidad ocular no decrementaron como en la situación de axotomía. Todos estos resultados apuntan a una alta potencialidad de los implantes de células madre para la reparación fisiológica tras una lesión. Además nuestros datos sugieren que el VEGF podría mediar una buena parte de los efectos beneficiosos conseguidos por este tipo de implantes.
3.- Adaptabilidad del sistema oculomotor tras la deaferentación selectiva de las motoneuronas oculomotoras del recto medial. Las motoneuronas que inervan el músculo extraocular recto medial están localizadas en el núcleo mesencefálico oculomotor. Estas motoneuronas reciben dos entradas sinápticas principales que se originan en la protuberancia y corresponden a: i) las neuronas internucleares del núcleo abducens, cuyos axones viajan por el fascículo longitudinal medial y ii) las neuronas del núcleo vestibular lateral, cuyos axones cursan por el tracto ascendente de Deiters. Con el objeto de comprobar las alteraciones inducidas tras la sección de cada vía, así como el grado de compensación alcanzado por la vía no lesionada, se procedió a seccionar o bien el fascículo longitudinal medial o bien el tracto ascendente de Deiters y a realizar registros de movimientos oculares y actividad neuronal. La lesión del tracto de Deiters produjo una disminución significativa en la ganancia del reflejo vestíbulo-ocular que duró pocos días (4 días en promedio) tras los cuales este reflejo logró recuperarse completamente hasta valores controles. Asimismo, la sección de este tracto no produjo alteraciones en los movimientos oculares espontáneos. En contraste, la lesión del fascículo longitudinal medial fue mucho más drástica, produciéndose igualmente una disminución del reflejo vestíbulo-ocular pero, en este caso, fue compensada tras un periodo mayor (20 días en promedio) mientras que las alteraciones producidas en los movimientos oculares espontáneos no se recuperaron en absoluto incluso tres meses después de la lesión. Estos datos ponen de manifiesto las capacidades adaptativas compensatorias de las vías que quedan intactas tras una lesión central. En nuestro modelo, se logró cierto grado de compensación motora, que tuvo características diferentes dependiendo de la vía que quedó intacta, y que fue el resultado de una plasticidad sináptica a nivel funcional, ya que no se encontró un rebrote colateral ("sprouting") o aumento de botones sinápticos procedentes de la vía no lesionada.
