Responsable: Guillermo Álvarez de Toledo Naranjo
Tipo de Proyecto/Ayuda: Plan Estatal 2013-2016 Retos - Proyectos I+D+i
Referencia: BFU2015-64536-R
Fecha de Inicio: 01-01-2016
Fecha de Finalización: 30-09-2019

Empresa/Organismo financiador/es:

• Ministerio de Economía y Competitividad

Equipo:

• Equipo de Investigación:
  • José Ángel Armengol Butrón de Mújica

Contratados:

• Investigadores:
  • María Ángeles Montes Fernández

Resumen del proyecto:

El normal funcionamiento del cerebro radica en la función precisa y controlada de las sinapsis, los elementos que conectan unas neuronas con otras para la transmisión de información. En contra de lo que pudiera parecer, experimentos muy recientes demuestran que el modelo clásico del funcionamiento sináptico de liberación de neurotransmisores y de reciclado de vesículas sinápticas puede ser distinto a lo establecido. En primer lugar, la existencia de liberación multivesicular en neuronas de hipocampo, corteza cerebral, cerebelo,y otras zonas del Sistema Nervioso Central (SNC) contrasta con la hipótesis cuántica clásica de Del Castillo y Katz. En segundo lugar, la extrema rapidez (ms) de endocitosis en zonas muy próximas a la zona activa descrito recientemente contrasta con la vía clásica de endocitosis mediada por clatrina en zonas periféricas de la sinapsis. Nuestro grupo ha trabajado en el ciclo de las vesículas sinápticas y en la liberación multivesicular durante años, trabajos que han tenido una repercusión importante, pues varios de los mecanismos por nosotros propuestos, liberación mediante kiss and run o la demostración directa de liberación cuántica de neurotransmisores mediante amperometría en células cromafines y mastocitos aparecen en libros de texto de Neurociencia o Biología Celular.

En el presente proyecto abordaremos el papel de la liberación multivesicular y la identidad de la membrana reciclada en zonas próximas a la zona activa mediante el uso combinado de técnicas de electrofisiología, adquisición de imágenes de fluorescencia de neuronas de hipocampo que expresan sondas genéticamente modificadas (Sinaptofisina-fluorina, SypHy) y microscopía electrónica. Los objetivos concretos de la presente propuesta son: 1) Estudio de la liberación cuántica y multivesicular en neuronas de hipocampo en cultivo mediante técnicas de fluorescencia. Se realizarán experimentos en neuronas transfectadas con SypHy y se cuantificará mediante análisis de imagen la respuesta secretora en botones únicos; 2) Dependencia de la concentración de calcio extracelular de calcio de la liberación multivesicular en neuronas de hipocampo. Se realizará el mismo tipo de análisis que en el objetivo anterior; 3) Estudio morfológico mediante microscopía electrónica de las sinapsis de neuronas del hipocampo tras la estimulación e inmediata crio-fijación de la muestra.

Se realizará una criofijación de la misma neurona registrada para la identificación de la membrana vesicular en el terminal presináptico, y 4) Estudio morfológico mediante microscopía electrónica del modelo de ratón Tambaleante, que parece tener alterado el mecanismo de recaptación de vesículas.

Esperamos con estos objetivos contestar a la pregunta de la significación de la liberación multivesicular, así como poder cuantificar el porcentaje contribuido por este mecanismo en la liberación de neurotransmisores. Del mismo modo esperamos contestar a la pregunta de si la liberación multivesicular se debe a la fusión de vesículas sinápticas que se han fusionado antes entre si para luego liberar su contenido de forma sincrónica. Por último, y pregunta más importante, esperamos identificar si la membrana reinternalizada en las zonas próximas a las zonas activas se corresponde con la membrana correspondiente a las vesículas fusionadas tras la estimulación. La identificación de esta membrana como la fusionada previamente sería la demostración última de la existencia del mecanismo de kiss-and- run