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Proyecto de investigación


Inestabilidad Genómica Asociada a Transcripción e Híbridos DNA-RNA

Responsable: Andrés Aguilera López
Tipo de Proyecto/Ayuda: Plan Estatal 2013-2016 Excelencia - Proyectos I+D
Referencia: BFU2013-42918-P
Fecha de Inicio: 01-01-2014
Fecha de Finalización: 30-06-2017

Empresa/Organismo financiador/es:

  • Ministerio de Economía y Competitividad

Equipo:

Contratados:

Resumen del proyecto:

Entender los mecanismos que alteran la estabilidad de los genomas es clave en la Biología Molecular y Biomedicina, dado su impacto en cáncer y en un número de enfermedades genéticas conocidas como raras. Un tipo de inestabilidad particularmente importante es el asociado a transcripción. La transcripción de una secuencia de ADN aumenta su frecuencia de recombinación y de mutación con consecuencias importantes en la dinámica e integridad de los genomas. Los híbridos de ADN-ARN son estructuras derivadas de la transcripción que pueden ocasionar conflictos entre las maquinarias de transcripción y replicación y tienen por tanto un impacto en la inestabilidad de los genomas. En este proyecto hemos profundizado en los mecanismos y factores responsables del fenómeno de inestabilidad asociada a transcripción mediante análisis moleculares y genómicos en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae y en células humanas. Tras un escrutinio y análisis funcional de una colección de mutantes de histonas en levaduras hemos demostrado que la cromatina es un gran determinante de la formación de estructuras de híbridos ADN-ARN. Así mismo, este trabajo nos ha permitido establecer la existencia de híbridos de ADN patogénicos y no patogénicos (García-Pichardo et al 2017). Por otra parte, en este proyecto hemos profundizado en las bases moleculares de la conexión entre la biogénesis de ARNm y la estabilidad genómica. Trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación, así como de otros laboratorios, han puesto de manifiesto que la formación de una correcta ribonucleopartícula (mRNP) es necesaria tanto para la expresión génica como para el mantenimiento de la integridad del genoma.  Nuestros datos indican que la célula mantiene el nivel de algunos factores de mRNPs controlados como es el caso de Yra1, proteína de unión al ARN, cuya sobreexpresión es deletérea debido en gran parte a la acumulación de híbridos de ADN-ARN y a problemas de replicación (Gavaldá et al 2016).  Así mismo, mediante el análisis de mutantes de proteínas necesarias para el transporte del ARNm a través del poro nuclear, como Mlp1 y Mlp2, hemos obtenido evidencias que indican que el anclaje de los genes transcritos al poro podría servir como mecanismo para regular la formación de híbridos ADN-ARN (García-Benítez et al 2017). Finalmente, hemos definido nuevas funciones de factores implicados en resolver conflictos transcripción-replicación como la helicasa Rrm3, definiendo su participación en reparación por intercambio de cromátidas hermanas (Muñoz-Galván et al 2017), o las proteínas de la ruta de reparación de Anemia de Fanconi, que hemos demostrado que participan en disolver R-loops (García-Rubio et al 2017). En la última parte del proyecto, hemos iniciado experimentos de ChIP-Seq que contribuirán a definir nuestros modelos de estudio a escala genómica.

Por actividades, estos han sido los logros.

Caracterización de la estructura de la mRNP en mutantes de levadura que acumulan R-loops. Hemos completado la purificación de mRNPs y análisis proteómico en mutantes de levaduras hpr1∆ que acumulan R-loops. Los resultados indican una menor asociación de la maquinaria de procesamiento de extremos 3’ y una mayor del exosoma y la maquinaria del nucleoporo. Nuestros datos indican que en ausencia de THO las mRNPs no son correctamente procesadas en su extremo 3’, de forma consistente con los defectos en transporte y estabilidad del ARNm observados en mutantes de levadura en trabajos previos de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación. Manuscrito en preparación.

Identificación y análisis de nuevos factores que interaccionan con THO-TREX para modular el mantenimiento de la integridad genómica en células humanas. Hemos llevado a cabo un escrutinio de doble híbrido utilizando como cebo diferentes subunidades del complejo. Como resultado hemos identificado nuevos factores que interaccionan con THOC1. Hemos determinado una interacción de THOC1 con el complejo histona desacetilasa Sin3A y llevado a cabo un análisis funcional  en células humnas con siRNAs, ensayos  cometas, inmunofluorescencia, ChIP y DRIP. Nuestros datos sugieren que un mayor grado de acetilación podría favorecer la formación de R-loops, como lo demuestran experimentos en células tras el silenciamiento de factores del complejo Sin3A y el uso de inhibidores de histona desacetilasas. Este trabajo ha servido para establecer una nueva conexión entre factores de la biogénesis de mRNP y remodeladores de la cromatina con objeto de prevenir de forma cotranscripcional la formación de R-loops. Los resultados obtenidos han sido incluidos en un articulo científico. Hemos validado una interacción de THOC1 con el factor de splicing MFAP1. La caracterización por análisis genético y transcriptómico con micromatrices ha contribuido a profundizar en el papel del complejo THO/TREX en la biogénesis y procesamiento del ARNm. Los resultados son objeto de un manuscrito en preparación. En paralelo hemos caracterizado el papel de la helicasa UAP56 proteína que forma parte del complejo THO/TREX en inestabilidad genómica. Los datos indican una mayor daño y acumulación y acumulación de R loops. Este trabajo constituye gran parte de la Teis Doctoral de C. Pérez-Calero.

Identificación de nuevas funciones que conectan la biogénesis de mRNA con R-loop e inestabilidad genómica. Hemos analizado la conexión entre la formación de R loop y la localización del ARNm en el poro nuclear mediante el análisis funcional de mutantes de levadura de los factores Mlp1 y Mlp2. Nuestros datos apoyan un modelo en el que el anclaje al poro del ARNm contribuiría a la regulación de la formación de híbridos ADN-ARN. Estos resultados constituyen la base de la Tesis Doctoral de F. García Benítez y publicación en la revista Proc Nat Acad Sci (ref. 15). Este trabajo se ha extendido al análisis  funcional de los genes ortólogos humanos en colaboración con el laboratorio del Professor M. Foiani (IFOM –Univerity of Milan). Por otra parte, hemos analizado el impacto de la mutación o sobreexpesión de diferentes factores de mRNP en la biogénesis del mRNA como la proteína rica en serina Npl3 y la proteína de unión al ARN Yra1. Los resultados indican que el factor Npl3 implicado en diferentes etapas del procesamiento del ARNm es además  necesario para prevenir la recombinación  e inestabilidad genómica dependiente de R-loop. Este trabajo ha constituido parte de la Tesis del Doctorando J.M. Santos-Pereira y ha sido publicado (1). Hemos demostrado que la sobreexpresión del factor Yra1 conduce a un aumento de la inestabilidad genómica dependiente de R-loop y a un acortamiento de los telómeros. Estos resultados han sido publicados (8). Por último, con objeto de identificar nuevas funcones que conectan la biogénesis de mRNA con R-loop e inestabilidad hemos llevado a cabo un analisis funcional de daño asociado a transcripción en mutantes de diferentes ARN/ADN helicasas. Este trabajo constituye parte de la Tesis Doctoral de J.F. La Fuente Barquero, (helicasa RecQL5) y una colaboración con el grupo de K. Cimprich (Stanford University) (Helicasa Aquarius), trabajo publicado en Mol Cell (21).

Determinación del papel de la cromatina y su remodelación en inestabilidad asociada a transcripción. Hemos finalizado un análisis de mutantes de histonas que pone de manifiesto el papel de la cromatina como factor relevante en la formación de R-loops. Así mismo este trabajo ha permitido establecer nuevas bases moleculares que explican la formación de híbridos patogénicos y no patogénicos. Este estudio ha dado lugar a una publicación (12) y ha constituido gran parte de la Tesis Doctoral de D. García-Pichardo. Actualmente estamos trabajando con librerías de compuestos químicos que tienen un impacto en modificaciones epigenéticas con objeto de poder establecer un conexón entre modificciones de la cromatina y la inestabilidad genética asociada a transcripción y formación de híbridos ADN-ARN.

Mecanismos por los que los R-loop afectan a modificaciones de histonas implicadas en heretocromatinización y condensación. Hemos analizado la relación entre la heterocromatinización y la formación de R-loops mediante el análisis de modificaciones de histonas como la marca de H3S10P en células eucariotas (levaduras y células humanas) desprovistas de factores que suprimern R-loops como factores de Anemia Fanconi y proteínas de biogénesis de mRNPs (THOC1, SETX, THSC/TREX2). El análisis con factores de Anemia Fanconi ha sido publicado en la revista PLoS Genetics (6) y ha dado lugar a una colaboración con el grupo de C.L. Schildkraut ( Albert Einstein College of Medicine), y una publicación (20). El análisis de mutantes THOC1, SETX se ha llevado a cabo en mutantes degron de levadura mediante ChIP-qPCR (H3S10P) y constituye parte de la Tesis Doctoral de M. San Martín Alonso. Otro objetivo ha consistido en explorar la posible conservación en la evolución de la relación cromatina heterocromatinización y algunos factores que evitan la formación de R loops. Para ello hemos analizado el complejo THSC/TREX2 en el organismo modelo C. elegans

Análisis genómico de los problemas de replicación, la estructura de la cromatina y el daño en el ADN en mutantes que acumulan R-loops. Hemos extendido nuestro conocimiento sobre el papel de la helicasa Rrm3 implicada en la resolución de conflictos de replicación , definiendo una función en reparación por SCE recombinación de cromátidas hermanas (11). Hemos puesto a punto ensayos de DRIP-Seq y disponemos de los primeros resultados de análisis genómicos en mutantes de genes que codifican factores que previenen la acumulación de estructuras R-loops. Estos datos a nivel genómico validan los resultados obtenidos en los objetivos previos.

Se han generado ademas otras publicaciones derivadas del proyecto relacionadas con factores implicados en replicación y la formación de R loops (10) y varias colaboraciones (16, 17,18,19) En estos últimos años, como resultado del trabajo, hemos sido invitados para la redacción de varias revisiones (2,3,4,5,7,9,13,14).

 

Publicaciones

1. JM Santos-Pereira, AB Herrero, S Moreno, A Aguilera.  2014.  Npl3, a new link between RNA-binding proteins and the maintenance of genome integrity.  Cell Cycle.  13(10):1524-9.  

2. A Aguilera, H Gaillard.  2014.  Transcription and Recombination: When RNA Meets DNA.  Cold Spring Harb Perspect Biol.  6(8):a016543. 

3. Gaillard H, García-Muse T, Aguilera A. 2015.  Replication stress and cancer.  Nat Rev Cancer. 15(5):276-89. 

4. Santos-Pereira JM, Aguilera A. 2015.  R loops, new modulators of genome dynamics and function.  Nat Rev Genetics.  16(10):583-97. 

5. Moriel-Carretero M,  Herrera-Moyano E, Aguilera A.  2015. A unified model for the molecular basis of Xeroderma pigmentosum-Cockayne Syndrome.  Rare Dis. 3(1):e1079362

6. García-Rubio ML, Pérez-Calero C, Barroso SI, Tumini E, Herrera-Moyano E, Rosado IV, Aguilera A.  2015.  The Fanconi Anemia Pathway Protects Genome Integrity from R-loops.  PLoS Genet.11(11):e1005674. 

7. Gaillard H, Aguilera A.  2016.  Transcription as a Threat to Genome Integrity.  Annu Rev Biochem.  85:291-317. 

8. Gavaldá S, Santos-Pereira JM, García-Rubio ML, Luna R, Aguilera A.  2016.  Excess of Yra1 RNA-Binding Factor Causes Transcription-Dependent Genome Instability, Replication Impairment and Telomere Shortening.  PLoS Genet. 12(4):e1005966

9. García-Muse T, Aguilera A. 2016.  Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved.  Nat Rev Mol Cell Biol.  17(9):553-63. 

10. Tumini E, Barroso S, Calero CP, Aguilera A.  2016.  Roles of human POLD1 and POLD3 in genome stability.  Sci Rep. 6:38873.

11. Muñoz-Galván S, García-Rubio M, Ortega P, Ruiz JF, Jimeno S, Pardo B, Gómez-González B, Aguilera A.  2017.  A new role for Rrm3 in repair of replication-born DNA breakage by sister chromatid recombination.  PLoS Genet.  13(5)e1006781. 

12. Garcıa-Pichardo D, Cañas JC, Garcıa-Rubio ML, Gomez-Gonzalez B, Rondon AG, Aguilera A.  2017.  Histone Mutants Separate R Loop Formation from Genome Instability Induction.  Mol. Cell  66:597-609. 

13. Bhatia V, Herrera-Moyano E, Aguilera A, Gómez-González B.  2017.  The Role of Replication-Associated Repair Factors on R-Loops.  Genes 8(7):pii: E171.

14. Aguilera A, Gómez-González B.  2017.  DNA-RNA hybrids: the risks of DNA breakage during transcription.  Nat Struct Mol Biol.  24(5):439-443. 

15. García-Benitez F, Gaillard H and Aguilera A.  2017.  Physical proximity of chromatin to nuclear pores prevents harmful R loop accumulation contributing to maintain genome stability. Proc Natl Acad Sci USA 114(41):10942-10947

16. Bravo M, Nicolini F, Starowicz K, Barroso S, Calés C, Aguilera A, Vidal M.  2015.  Polycomb RING1A/RING1B-dependent histone H2A monoubiquitylation at pericentromeric regions promotes S phase progression.  J Cell Sci. 128(19):3660-71. 

17. Hohl M, Kochańczyk T, Tous C, Aguilera A, Krężel A, Petrini JH.  2015.  Interdependence of the rad50 hook and globular domain functions.  Mol Cell.  57(3):479-91. 

18. Stuckey R, García-Rodríguez N, Aguilera A, Wellinger RE.  2015.  Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system.  Proc Natl Acad Sci U S A. 112(18):5779-84. 

19. Andersen SL, Zhang A, Dominska M, Moriel-Carretero M, Herrera-Moyano E, Aguilera A, Petes TD.  2016.  High-Resolution Mapping of Homologous Recombination Events in rad3 Hyper-Recombination Mutants in Yeast.  PLoS Genet.  12(3):e1005938. 

20. Madireddy A, Kosiyatrakul ST, Boisvert RA, Herrera-Moyano E, García-Rubio ML, Gerhardt J, Vuono EA, Owen N, Yan Z, Olson S, Aguilera A, Howlett NG, Schildkraut CL.  2016.  FANCD2 Facilitates Replication through Common Fragile Sites.  Mol Cell. 64(2):388-404.

21. Sollier J, Stork CT, García-Rubio ML, Paulsen RD, Aguilera A, Cimprich KA.  2014.   Transcription-coupled nucleotide excision repair factors promote R-loop-induced genome instability. Mol. Cell 56(6):777-85 

 

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